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                  PCR凝膠電泳問題,全都總結出來了!

                  發布時間: 2024-05-31  點擊次數: 45次

                  1.Marker相關問題

                  1.1Marker 不直,偏斜或拖尾

                  原因:

                  1.膠配制的問題,制作不均勻或有污染或瓊脂糖質量不好;

                  2.電泳緩沖液過于老舊,考慮更換;

                  3.電壓太高,凝膠受熱導致不均勻;

                  4.電泳槽的電極歪斜;


                  1.2Maker 跑不開

                  原因:

                  1.膠濃度太大;

                  2.電泳時間太短;


                  2.PCR產物相關問題

                  2.1沒條帶

                  原因:

                  沒跑出來


                  2.2條帶微弱

                  原因:

                  1.DNA降解

                  2.上樣量過少

                  3.沒跑出來,產物濃度過低,需再次PCR


                  2.3非特異性擴增

                  原因:

                  1.引物設計不合理。需重新設計引物,balst檢測引物特異性;

                  2.試劑被污染。包括水,酶,引物等。重新更換;

                  3.退火溫度太高。提高退火溫度,增加退火時間,減少循環數;

                  4.酶加入過多;


                  2.4 PCR產物彌散,拖尾或偏斜,Maker正常

                  原因:

                  1. 引物保存不當,降解。重新配制引物工作液。

                  2.模板降解或過量。重新檢查模板質量,減少模板用量。

                  3.非特異性擴增。提高退火溫度,增加退火時間,減少循環數。

                  4.酶量過多或酶的質量差。

                  5. 有蛋白和鹽的污染。


                  2.5 PCR產物和Maker 都彌散或拖尾

                  原因:

                  1.膠配制的問題,制作不均勻或有污染或瓊脂糖質量不好;

                  2.電泳緩沖液過于老舊,考慮更換。

                  3.電壓太高,凝膠受熱導致不均勻。


                  2.6 PCR產物與目的大小不符合

                  原因:

                  1.引物特異性不好。需重新設計引物,balst檢測引物特異性。

                  2.存在新的異構體。

                  3.是目的基因,但大小有差異(我遇到過)。膠回收過后再次電泳條帶變為正常大小。遇到這個情況可以測序看看結果。


                  2.7 電泳孔亮

                  原因:有蛋白或者多糖的污染,這些大分子物質影響了DNA或RNA的出孔,使其停留在孔中或者出孔很慢。導致孔以及接近孔的位置很亮。

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