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                  瓊脂糖凝膠電泳實驗的注意事項

                  發布時間: 2024-05-31  點擊次數: 37次

                  一、瓊脂糖凝膠的特點

                  核酸分子是兩性解離分子,在高于其等電點的電泳緩沖液中,其堿基不解離,而磷酸基團全部解離,核酸分子因而帶負電荷,電泳時向正極遷移。


                  瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來并經糖基化修飾,為一種聚合鏈線性分子,使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質,發揮分子篩功能,使得大小和構象不同的核酸分子的遷移率出現較大差異,從而達到分離的目的。


                  因此,目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳,其優點如下。


                  (1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單,電泳速度快,樣品不需事先處理就可以進行電泳。


                  (2)瓊脂糖凝膠結構均勻,含水量大(約占98%-99%),近似自由電泳,樣品擴散較自由電流,對樣品吸附極微,因此電泳圖譜清晰,分析率高,重復性好。


                  (3)瓊脂糖透明無紫外吸收,電泳過程和結果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。


                  (4)電泳后區帶易染色,樣品極易洗脫,便于定量測定。制成干膜可長期保持。


                  二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳

                  瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用主要是依據它們的相對分子量質量及分子構型,同時與凝膠的濃度也有密切關系。


                  1.核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關系

                  (1)DNA分子在凝膠中,DNA 片段遷移距離(遷移率)與堿基對的對數成反比,因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較,便可測出未知片段的大小。


                  (2)瓊脂脂糖的濃度如下表所示,不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。


                  瓊脂糖濃度與DNA分離范圍:

                  圖片

                  2.核酸構型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關系

                  不同構型DNA的移動速度次序為:供價閉環DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直線DNA>開環的雙鏈環狀DNA


                  當瓊脂糖濃度太高時,環狀DNA不能進入膠中,相對遷移率為0(Rm=0),而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性狀棒)則可以長軸方向前進(Rm>0),由此可見,這三種構型的相對遷移率主要取決于凝膠濃度,但同時,也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。


                  三、瓊脂糖凝膠電泳實驗方法

                  1、選擇適合樣品預期片段大小的瓊脂糖凝膠濃度百分比。將瓊脂糖粉末與用于運行凝膠的相同類型的緩沖液(TAE)結合起來,加熱使混合物融化,避免沸騰。


                  2、選擇所需尺寸的凝膠澆注模具和梳子,為樣品和marker提供足夠數量的孔,以及容納每個待裝樣品數量的孔容量。


                  3、膠凝固后,將凝膠放入電泳儀中,電泳液沒過凝膠,根據加入量的多少,決定混合多少ul的loding buffer,將樣液混合loding buffer用移液槍加入到凝膠中。


                  4、蓋上蓋子,確保電極和蓋子的方向正確,注意正負極,打開電泳儀,設定凝膠運行的時間和電壓,根據樣品大小確定運行時間。


                  四、瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧和注意事項

                  1、瓊脂糖凝膠溶液配制時總液體量不宜超過錐型瓶50%容量。


                  2、加熱時可以中途搖動搖動,防止瓊脂糖凝膠凝在錐形瓶底部。


                  3、注意不要損傷梳底部的凝膠。防止加樣時樣品漏出。


                  4、凝膠濃度越低,分辨的片段越大;凝膠濃度約高,分辨的片段越??;


                  5、使用紫外投射儀觀察,紫外光對DNA分子有損傷作用,不可長時間照射。從膠上回收DNA時,應盡量縮短光照時間以減少紫外光切割DNA。


                  6、紫外燈下觀察時應戴上防護鏡,以免損傷眼睛。



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