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                              酵母雙雜交(Y2H)實驗操作指南

                              發布時間: 2024-03-21  點擊次數: 158次

                              酵母雙雜交系統(Yeast two hybrid,Y2H) 常用于分析兩種蛋白質的相互作用。將兩種蛋白質分別克隆到酵母表達質粒的轉錄激活因子的DNA結合結構域(DNA-BD)和轉錄激活域(AD)上,構建成融合表達載體,從而分析兩種蛋白質的相互作用。


                              pGBKT7是酵母雙雜交bait表達載體,旨在表達GAL4 DNA結合結構域(DNA-BD,1-147 aa)與bait蛋白質的融合蛋白質。pGADT7是酵母雙雜交表達載體,旨在表達GAL4激活結構域(AD, 768-881 aa)與目的蛋白質的融合蛋白質。


                              圖片

                              一、酵母感受態細胞制備

                              (1) 將-80℃保存的酵母菌株在YPDA固體培養基平板上劃線,30℃培養條件下倒置培養4-7d。

                              (2) 挑取單菌落至含3mLYPDA液體培養液中。

                              (3) 30℃培養,200rpm 震蕩培養8h。

                              (4) 當菌液OD值約為0.3時,轉移10uL菌液到含50mIYPDA培養液中。

                              (5) 30℃培養,200rpm震蕩培養16-20h至OD值為015-0.3。

                              (6) 700g轉速5min室溫離心收集細胞。

                              (7) 將底部沉淀使用已預熱至30℃的100mLYPDA中重懸酵母細胞。

                              (8) 30℃,200rpm,搖3-5h至OD值=0.6時。

                              (9) 5min室溫離心收集細胞。

                              (10) 將底部沉淀在30mL無菌超純水中重懸酵母細胞.

                              (11) 700g轉速5min室溫離心收集細胞。

                              (12) 將底部沉淀加入3mL的1.1XTE/LiAc重懸細胞。

                              (13) 將懸重懸細胞分成2管,6000g轉速室溫離心30s。

                              (15) 將底部沉淀加入500uL的1XTE/LiAc重懸酵母細胞,分裝為100uL每管。

                              二、轉化

                              (1)在干凈的1.5 mL的離心管中并振蕩混勻。

                              (2)每個離心管中加入100 µL的酵母感受態細胞,500 µL的PEG/LiAc溶液,加入兩種質粒,并且將管中的混合物進行旋渦振蕩,將其混勻。

                              (3)在30℃,220 rpm/min的搖床振蕩培養30 min。

                              (4)往每個離心管中加70 µL的DMSO,并溫和的上下顛倒混勻。將離心管在42℃水浴中熱激40 min(每隔10 min搖勻1次)。

                              (5)取出離心管,在冰上靜置2 min。

                              (6)吸取100 µL并涂布在相應的二缺固體培養基上,培養3-4天,待菌長好后,挑單菌落于10ulYPDA液體培養基中,30℃培養過夜。

                              互作驗證:

                              取過夜培養的菌液涂布于四缺平板上,將培養皿置于30℃恒溫培養箱中培養,觀察是否生長與顏色變化。

                              注意事項:

                              (1)檢測感受態細胞效率,標準操作規范。

                              (2)注意質粒使用量,檢查儀器狀態。

                              (3)配制新鮮培養基,并做對照轉化,添加抑制劑,同時增設嚴格的對照組防止自激活。

                              (4)應挑選大的、新鮮的菌株克隆進行培養。

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