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                              Western Blot全流程實驗步驟及常見問題詳解

                              發布時間: 2024-03-20  點擊次數: 118次

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                              一、原理

                              蛋白質免疫印跡法即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法,基本原理是經過 PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜(NC膜)或PVDF膜上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

                              二、流程圖:

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                              (一)蛋白上清液提?。?/strong>

                              a、準備工作:分裝需要體積的蛋白裂解液(IP/RIPA),再分別加蛋白酶抑制劑(蛋白裂解液:PMSF 體積比為100:1),磷酸化蛋白酶抑制劑(蛋白裂解液:磷酸化蛋白酶抑制劑體積比為100:2)于蛋白裂解液中,加入Aprotinin 蛋白酶抑制劑,蛋白裂解液:Aprotinin(500×)體積比為 100:0.2;


                              b、剪取適量組織(盡量保證每一粒樣品都剪去的一樣多)和適量混勻的蛋白裂解液于勻漿器中磨勻(0.01g組織加上50-100ul的蛋白裂解液),直至看不見組織塊;


                              c、轉移勻漿液于 1.5ml 離心管中,置于冰上蛋白裂解10min;


                              d、提前開離心機預冷,4℃,12000rpm 離心 15min ;


                              e、將離心后的上清分裝轉移倒 1.5ml 新的離心管中,部分用于實驗多余的存于-20℃;


                              若實驗對象為細胞:懸浮細胞、貼壁細胞

                              懸浮細胞:

                              ①收細胞:細胞懸液收集到離心管中,5000rpm,去上清,加1mlPBS,5000rpm,5min,加50ulIP/RIPA裂解液,冰上裂解20-30min;


                              ②打蛋白:超聲儀,探頭使用前用純水清洗,探頭伸入液面以下,避免太多;設置程序:(打3s,停3s,共計92次);破碎細胞后,4℃,12000rpm,10min離心,取上清(蛋白),蛋白置于冰上或放置-80℃。

                              注意:

                              ①貼壁細胞:先用PBS緩沖液清洗兩遍,然后加入蛋白裂解液(IP/RIPA),然后用細胞刮板將細胞+蛋白裂解液移至離心管中。

                              ②一管細胞打20次左右,打蛋白的過程中會發熱,可暫停置于冰上數秒。


                              BCA測蛋白濃度:(通常利用BCA試劑盒測定),基本流程如下:

                              96孔板:(一般最外圍的孔不利用或加等體積的PBS溶液防止污染和蒸發)

                              (1)蛋白標準品BSA做標曲,取7個EP管,編號①-⑦

                              (2)濃度:①2、②1、③0.5、④0.25、⑤0.125、⑥0.0625、⑦0(單位:mg/ml)

                              (3)②-⑦+50ulPBS,①-②+50ulBSA

                              (4)②混勻,取50ul加③,依次加到⑥

                              (5)配樣品濃度:45ulPBS+5ul樣品濃度,配完短暫離心混勻(計算濃度時×10)

                              (6)配制工作液,配完避光,現配現用(A液:B液=50:1,一個孔要200ul工作液):一個樣要2個重復孔,計算體系:7個標準品+1個待測液溶液×2,共計16孔;防止加樣誤差,配置20個體系,一個200ul(20×200=4000ul/4ml)

                              (7)加樣到96孔板:一個孔:20ul蛋白溶液+200ulBCA工作液;標準品從⑦-①加,兩個平行孔一起加。

                              (8)37℃孵育30min(孔板底部勿觸碰,保持干凈)

                              1. 測562nm處OD值,制作標準曲線(excel)

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                              圖1 37℃恒溫箱孵育后,下一步酶標儀測定OD值
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                              a 將上步蛋白上清液與 5×loading buffer 4:1 混勻,
                              b 在沸水中煮 5min,水浴結束后,常溫離心(瞬離),制膠后用于上樣。
                              (二) 配膠
                              1、制膠:濃縮膠/上層(5%);分離膠/下層(根據蛋白分子大小而定)
                              (1)制膠前用純水檢漏,加入純水放置2-3min;
                              (2)配制下層膠:試劑盒配置好的膠液靠邊注入玻璃板(盡量不要產生氣泡);加入無水乙醇/雙蒸水壓平膠面,靜置等膠凝固(根據天氣室溫變化,一般30min以上);配制上層膠:下層膠凝固后倒掉無水乙醇/雙蒸水,濾紙吸干,上層膠緩緩注入,插梳子,等待凝固(約1h)
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                              圖2 制膠完成后
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                              (三)電泳

                              1、配制上樣體系:蛋白溶液+5×loading buffer+PBS 蛋白上樣量:20-50ug

                              2、上樣:最左和最右孔可加SDS-PAGE loading buffer壓平條帶;可與最中央或左右兩端各加入3-5ul的蛋白maker;蛋白樣品上樣(9ul)
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                              圖3、4 上樣,80v電壓
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                              圖5 蛋白maker分離
                              3、將膠置于電泳槽中,倒入電泳緩沖液,內部要漫過矮板,外部要漫過玻璃板底部;
                              4、準備樣品 maker 于冰盒上,順序排好,上樣,并在實驗本上記錄好;

                              5、蓋上電源蓋,正負極相互對應,接通電源,恒壓濃縮膠80V,30min或maker分離后可更改電壓為120v,跑分離膠。待 loading buffer中的溴酚藍跑至腳底部 1cm 處停止電泳。整個時間大概為 1.5h-2h。


                              (四) 轉膜
                              1、根據 maker 的指示,分別切出對應需要分子量蛋白的膠;并用尺子量取膠的寬度;
                              2、準備6張與膠同樣大小的濾紙和1張NC膜一起放入轉膜緩沖液中,至浸透。使用PVDF膜需要用甲醇激活。
                              3、按照3張濾紙,膜,膠,3張濾紙的順序依次放好,要求中間沒有氣泡。將電泳夾輕輕夾緊,放入電泳儀中,要求膠靠近負極(電泳儀中的黑色一面)膜 靠近正極(電泳儀中紅色一面),倒入電泳緩沖液沒過有膠的地方。
                              4、蓋上電源蓋,接通電源,轉膜,不同的分子量轉膜時間不同;(例如300mA,1h,20-25KD)
                              注意:
                              ①黑面朝上,組裝結構為:(黑)海綿—濾紙(2-3張)—膠—膜—濾紙(2-3張濾紙)—海綿(紅or白)。如下圖:
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                              圖6 “三明治"組裝順序
                              ②轉模槽需埋入冰中,防止轉膜過程中甲醇產熱溫度過高。

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                              (五) 封閉
                              配制 5%脫脂牛奶,質量體積比為1g脫脂奶粉:20ml 1×TBST 。將轉完后的膜用 5%脫脂牛奶封閉至少1h。
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                              裁膜孵育抗體:(注意:一些期刊雜志現在不允許裁膜)
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                              1、配置抗體,稀釋比例根據抗體說明書的要求配置,稀釋液一般為一抗稀釋液。
                              孵育時間根據季節溫度變化,夏天:4℃過夜,第二天室溫搖床30~60min,直至抗體溫度為室溫;
                              冬天:室溫搖床 60min~180min,4℃過夜,第二天室溫搖床60-120min,直至抗體恢復到室溫。

                              2、洗膜 1×TBST 洗3次,5min一次。


                              (七) 二抗孵育
                              1、配置抗體,稀釋液為 1×TBST,比例需根據說明書要求大概為 1:3000~1:4000。
                              孵育時間為,夏天:室溫搖床 30-60min;冬天:室溫搖床 60min-180min。
                              2、 洗膜 1×TBST 洗3次,5min一次。

                              注意:一抗,二抗孵育洗膜時間可以靈活調整,一般3-5次,5min一次


                              (八) 顯影曝光
                              1、試劑盒A液+B液現配現用(A:B=1:1),避光保存;
                              2、夾起膜放入玻璃皿中,吸顯影液滴在膜上,確保顯影液浸潤到了膜所有地方;
                              3、image Lab曝光步驟:膜放置皿中(小口徑玻璃皿中)—打開儀器(image lab),膜放入機器—選擇印跡—colorimetic—自動曝光—拍白光圈
                              4、曝光拍照(CHEMI)—選擇“放置凝膠"——設置曝光時間(自動or手動)—凝膠成像—保存
                              注意:一抗原液(1:1000)稀釋,若顯影條帶較暗可適當提高比例如1:500

                              Eg:5ul一抗原液+5000ul(5ml)一抗稀釋液


                              注意事項
                              1 、條帶形狀成彎狀可能原因有:
                              (1)跑膠電泳過程發熱,電泳需要低溫;
                              (2)轉膜電泳過程發熱,轉膜需要低溫;轉膜過程上下層濾紙接觸,會導

                              致局部短路,也散發熱量。

                              2、條帶畸形最主要可能是膠沒有混勻,轉膜過程中膠與膜中間有氣泡。條

                              帶拖尾,應該是蛋白雜質較多。

                              3、 配膠用玻璃板和邊條應及時洗凈。玻板未洗凈的壞處很多。盡管玻璃看

                              似平滑,但是一些細微的凹陷處會凝結肉眼無法分辨的膠顆?;蚋泶?,可能會導致在該部位極易導致不均勻的膠塊,樣品經過該處或電泳散熱不好,條帶變形。

                              4、背景深

                              (1)封閉問題,牛奶液體沒有覆蓋膜;
                              (2)降低一抗濃度,孵育時間;

                              (3)縮短二抗孵育時間;

                              5 、沒有條帶

                              首先利用麗春紅對膜染色,若有條帶在,就說明是轉膜后面的封閉一抗二抗操作有問題,我們可通過調節后面的實驗條件,重新對膜進行處理,最后還是沒出不排除一抗有問題;

                              若麗春紅染色沒有條帶,則可以放棄此膜,轉膜前面的步驟哪里出錯,有可能蛋白濃度低或蛋白未提出。

                              6 、曝光過后,若是β-actin 這樣的內參很明顯的降解成了兩條帶,則說明5×loading buffer 中 DTT 或是β-巰基乙醇這類的還原劑失效。

                              GAPDH內參不齊,可能是一抗使用多次,更換新的一抗,或者是上樣量的問題。
                              7、對于特殊的分子量如小于10KD,大于300KD 的蛋白,久未做出,可選擇更改膜的品種,如 PVDF 膜,它親和蛋白的能力大于NC膜,而且它根據膜的孔徑半徑分為幾種型號(4.5um/0.22um),可選擇適合的型號來轉特殊分子量的蛋白,
                              一般蛋白分子大于20KD選擇使用0.45um,小于20KD選擇0.22um孔徑的。
                              8 、配置30%SDS(聚丙烯酰胺)室溫保存,也可直接用購買的SDS試劑。

                              9 、APS(過硫酸銨)會失效,10%APS一般保質期才一個月左右,APS失效膠會不凝,要4℃避光保存。


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