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                              您當前的位置:首頁 > 技術文章 > 三天征服Chip的經驗分享

                              三天征服Chip的經驗分享

                              發布時間: 2021-09-13  點擊次數: 1450次

                              在科研界,CHIP 無疑是高冷的女神,在追逐的過程總是分分鐘虐得體無完膚,糟心的實驗結果更是分分鐘想去“狗帶"。征服 CHIP 的路上,有多虐心就有多少要注意的地方。慶幸的是,曾得到女神青睞的前輩們積累了不少經驗。好的經驗要分享,特地總結了各位高手們做 CHIP 的經驗,在此奉上,希望能助大家一臂之力。

                              染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)是目前研究體內 DNA 與蛋白質相互作用的*方法,能夠比較真實的反應細胞內轉錄因子 TF 與啟動子 Promoter 的結合情況。其基本原理:在活細胞狀態下,把胞內 DNA 與蛋白質交聯成復合物,通過超聲或酶處理將染色質隨機切斷為一定長度范圍內的小片段,然后利用抗原抗體特異性識別反應,將與目的蛋白結合的 DNA 沉淀下來,特異性富集目的蛋白結合 DNA 片段,進而對目的片斷進行純化與檢測(如 qPCR、基因芯片、測序等),從而獲得蛋白質與 DNA 相互作用的信息。

                              CHIP 主要分為兩種:交聯染色質免疫沉淀(Cross-linkedChip,XChip)和自然染色質免疫沉淀(Native Chromatin Immunoprecipitation, NChip)。兩者的區別在于 XCHIP 需要甲醛固定,適合于結合力較弱的 DNA-蛋白質相互作用的研究;而 NCHIP 則不需要甲醛固定,不需要交聯反應,主要用于組蛋白修飾(如組蛋白 H3 和 H4,它們本身與 DNA 結合非常緊密)、核小體定位的研究。在 NCHIP 中,DNA 結合蛋白與 DNA 之間保持一種自然狀態,需要采用微球菌核酸酶對染色質進行消化。 一般而言,我們所提的染色質免疫共沉淀指的是 XCHIP。那么長話短說,將 XCHIP 三天實驗中的常見流程及注意事項分享給大家。 


                              第一天 

                              細胞的甲醛交聯 

                              1)收集細胞,加入甲醛(終濃度為 1%),37℃孵育 10min 后,加入甘氨酸(終濃度為 0.125M),混勻后在室溫下放置 5min 即可。 

                              2)離心棄上清,收細胞于 15ml 離心管中,用 3ml 預冷的 1×PBS 洗兩次后,預冷后 2000rpm  5min 收集細胞。 

                              3)棄上清,按照細胞量,加入 SDS Lysis Buffer,使細胞濃度為 1×106 個/100 ul。再加入蛋白酶抑制劑復合物。

                              Tip: 

                              1、細胞生長狀態要好,因其生長狀態直接影響細胞內部的基因表達調控網絡,可能會影響你所研究的 TF 與 Promoter 的結合。因而,一般細胞長到 75%-80%比較好。

                              2、交聯程度會影響到超聲破碎的效果,交聯程度越高,超聲破碎就越不易把基因組打碎成小片段,背景色加深;交聯不充分,則只有一部分靶蛋白與 Promoter 結合,富集得到的 Promoter 的量不高,產生實驗假陰性。建議樣品交聯的時間為 2-30min。 

                              3、用 SDS 重懸細胞時,要選用小的 tip 頭,在液面下吹打,否則很容易產生氣泡,會對后續超聲破碎帶來不便。


                              超聲破碎 

                              1)冰上孵育 10min 后,利用超聲波或微球菌酶將染色質隨機切為 200~1000bp 的小片段。 14000rpm 離心 10min(4℃),轉移上清于 1.5ml EP 管中。 

                              2)取出 100ul 超聲破碎產物,加入 4ul 5M NaCl(終濃度為 0.2M),65℃處理 4h 進行解交聯,電泳檢測超聲破碎的效果。 

                              3)另取出 100ul 超聲破碎產物,加入 900ul ChIP Dilution Buffer 和 20 ul 的 50× PIC,再加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA,去除非特異性。4℃顛轉混勻 1h 后,1000rpm 離心 3min,收集上清。

                              Tip: 

                              1、不同細胞系需不同的超聲時間才能達到*效果,則可通過時間梯度的超聲來選擇*超聲條件。

                              2、每份超聲樣品取 50ul,標記為 input,用于定量 DNA 濃度(稀釋 200 倍,測 OD260)和作為 PCR 空白對照。同時超聲后樣品應立刻存于-70℃中,避免多次反復凍融。 

                              3、加入 Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA 之前一定要混勻,因為 Salmon sperm DNA 是很粘稠的物質,若不混勻,后面 beads 量不一樣,對實驗結果產生影響。


                              第二天 

                              免疫共沉淀

                              1)一管加入 1ul 抗體,另一管中則不加抗體作為對照。4℃顛轉過夜。 

                              2)孵育過夜后,每管加入 60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA,沉淀抗體/抗原復合物, 4℃顛轉 1h。1000rpm 4℃ 3min 收集沉淀,棄上清。 

                              Tip: 

                              1、每個樣品都采用 25ug 的 DNA 量,同時抗體的量為 1-10ug 的抗體/25ulDNA。 

                              2、單抗與多抗的選擇也需慎重考慮。單抗特異性強,背景低,但是識別位點單一,在 CHIP 甲醛交聯過程中,很有可能該位點被其他蛋白或核酸結合而被封閉,導致單抗不能識別靶蛋白。多抗雖然沒有此問題,但是特異性差,背景可能會偏高。一般建議選擇多抗;選擇單抗時要注意其識別位點需遠離靶蛋白與核酸結合的區域。


                              純化 DNA 片段 

                              1)依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗過程:加入溶液 1ml,在 4℃旋轉 5min,1000rpm  3min,去除上清。 

                              洗滌液: 低鹽免疫復合物洗脫液,洗一次;高鹽免疫復合物洗脫液,洗一次;氯化鋰免疫復合物洗脫液,洗一次; TE Buffer,洗兩次。

                              2)清洗完畢后,進行洗脫。每管加入 250ul 洗脫液,室溫下顛轉 15min,1000rpm 3min,收集上清液。最終的洗脫液為每管 500ul。

                              洗脫液: 100ul 10% SDS,100ul 1M NaHCO3 ,800ul ddH2O ,共 1ml。 

                              3)解交聯:每管加入 20ul 5M NaCl(終濃度為 0.2M),混勻后,65℃解交聯過夜。

                              Tip: 

                              1、洗滌時,前幾個步驟可以不用洗的太干凈,但最后一個要盡量吸取干凈,必要時可用 gel  loading tips 吸取上清液。 

                              2、含 beads 的樣品離心時,轉速不能太快,防止 beads 破碎,但如果采用的是磁性的 beads 就不存在這個問題。 

                              3、解交聯時,建議在離心前,先把蒸發到離心管蓋子上的部分離下來。


                              第三天 

                              DNA 樣品的回收 

                              1)每管加入 1ul RNaseA(MBI),37℃孵育 1h。 

                              2)每管加入 10ul 0.5M EDTA,20ul 1M Tris.HCl(pH 6.5),2ul 10mg/ml 蛋白酶 K。45℃處理 2h。

                              3)DNA 片段回收—OMEGA 膠回收試劑盒,最終的樣品溶于 100ul ddH2O

                              Tip: 

                              1、樣品中 SDS 含量較高時,普通 PCR 回收試劑盒進行 DNA 片段回收時,在過柱前,可在樣品中加入一定量的異丙醇,這樣可有效消除 SDS 沉淀。 

                              2 、一個 CHIP 一般需要 3~4 天時間,其中有幾個步驟是可以停下來的: 

                              (1)細胞收集:用含蛋白酶抑制劑的 PBS 洗滌離心,去上清的細胞收集液可置-80℃凍存; 

                              (2)用 SDS 重懸細胞后可置-80℃凍存; 

                              (3)超聲破碎結束時,離心后的上清置新的離心管后可置-80℃凍存;

                              (4)解交聯后的標本可置-80℃凍存


                              DNA 樣品分析 

                              如果目的蛋白的靶序列已知,或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列,可選用定量或者半定量 PCR 方法。如果目的蛋白的靶序列未知或要研究目的蛋白基因組分布情況,找出轉錄因子結合位點,則可采用 CHIP 克隆測序(CHIP-seq)、CHIP-chip 等方法。

                              PCR 分析 

                              目前檢測方法主要有 3 種: 

                              CHIP-qPCR:用于比較沉淀的模板與陰性和陽性對照信號強度的相對精確的定量 PCR 方法。成本較低。此外,還有一些由 ChIP 衍生出來的方法,如 RIP(即用 ChIP 的方法研究細胞內 蛋白與 RNA 相互結合,具體方法和 ChIP 差不多,只是實驗過程中要注意防止 RNase,最后 分析時需先將 RNA 逆轉錄為 cDNA)

                              Tip : 

                              1、1~10ul 的移液槍取 3ul 以上才比較準確,要考慮好自己 PCR 反應體系的配置。 

                              2、每次 qPCR 之前都要把 sample 離心保證取樣的準確。 

                              CHIP-chip:Chip 和 DNA 微陣列芯片技術結合是種高通量分析 DNA 和蛋白質結合或翻譯后染 色質和組蛋白修飾的方法。即將經過染色質免疫共沉淀的 DNA 樣品純化后進行 PCR 擴增, 然后用熒光素標記(如 Cy3)。對沒有經過免疫沉淀反應富集的 Input DNA 樣品也進行擴增, 并且用另一種熒光素標記(如 Cy5),作為結合背景的參照。之后將這兩種 DNA 雜交于包括 基因組序列的微陣列芯片上,轉錄因子結合的靶序列用每個點相應的熒光強度來確定。

                              CHIP-seq:在測序深度和范圍足夠的情況下,ChIP-seq 可以檢測到所有的組蛋白修飾所對應的 DNA 結合位點。ChIP-seq 首先通過染色質免疫共沉淀技術特異地富集目的蛋白結合的 DNA 片段,并對其進行純化與文庫構建,然后以 NGS 技術對富集到的 DNA 片段進行高通量測序。 

                              (NGS 技術主要是利用 DNA 新模板的合成或連接過程, 用高效平行的方式同時對 DNA 模板 進行測序, 從而獲得大量的測序數據, 即所謂的大規模平行測序。)


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